GST pull down实验原理●


GST pull down是将GST融合蛋白作为探针固化到凝胶柱上，与溶液中的目的蛋白相结合。可用来确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间的新的相互作用。先将体外表达的GST融合蛋白结合到谷胱甘肽Beads上，再将靶蛋白-GST-Beads和细胞裂解液孵育，这样互作蛋白便一起吸附在Beads上。洗涤掉未结合的蛋白后，再用洗脱液将互作蛋白复合物从Beads洗脱下来，即GST pull down产物。这种互作复合物既可以用WesternBlot检测已知蛋白，也可用质谱鉴定出未知蛋白。辉骏生物可制备GST融合蛋白，多种GST pull down蛋白互作方案供客户选择，bao证GST融合蛋白沉降技术服务到成功发表文献。


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GST pull down实验详细步骤流程

图：GST pull down实验步骤流程

应用领域

GST pulldown应用背景

蛋白质是几乎所有生命活动的直接效应分子，并且在行使功能的时候往往不是单打独斗的，蛋白质之间经常形成复合体，并且在工作过程中还会不断的更换相互作用的伙伴，从而行驶不同的功能。因此，研究蛋白质的相互作用成为研究蛋白质功能和作用机制的樶为重要的环节之一。



常见的蛋白相互作用方法主要有免疫共沉淀（Co-IP）、pull down、酵母双杂交、荧光双分子互补（BiFC）、荧光共定位等。



pull down技术将目标蛋白进行体外原核表达，使标签蛋白（GST或His等）与目标蛋白融合表达，借助标签的亲和介质将目标蛋白纯化出来，可以不受抗体、物种限制，比较轻松的获得目标蛋白的结合蛋白，还可以通过外源同时表达目标蛋白和待测蛋白，确定它们是否发生直接的相互作用，但该方法无法得知体内真实的结合情况。



Co-IP技术采用目标蛋白的抗体捕获样本中的目标蛋白及其互作蛋白复合物，反应的是体内真实的生理结合，但是不能显示这些相互作用是直接还是间接的；另外合适的免疫共沉淀抗体是决定实验成功的关键，有些蛋白没有可用的IP抗体，无法进行内源性Co-IP实验；通过构建带标签的表达载体，使目标蛋白与标签融合表达，借助标签抗体可以完成Co-IP实验，但需要注意合适的转基因方法又是影响该方法成功的关键。



酵母双杂交技术是比较古老的一种技术，将目标蛋白和待测蛋白与GAL4 的两个结构域BD和AD融合表达，在酵母细胞中，2个蛋白的结合使得BD和AD在空间上靠近，从而激活报告基因lacZ的表达。但是由于受试蛋白都需要和 AD/BD 结构域形成融合蛋白，空间构象可能改变；另外假阳性率也比较高。



荧光双分子互补（BiFC）技术将目标蛋白和待测蛋白分别与GFP的两个片段融合表达，转染细胞后，2个蛋白的结合使得GFP两个片段空间上靠近，从而发出绿色荧光，该技术观测直观，操作简便，但空间分辨率大约 250nm，对于蛋白质相互作用来说依然是个相当远的距离，因此位置上靠近但并未结合的蛋白也可能显示阳性结果，假阳性率较高；另外该技术可以验证蛋白间的相互作用，但不能筛选未知互作蛋白。



荧光共定位技术依靠荧光确定蛋白质具有相同定位，用于辅助证明而非直接证明细胞内蛋白间的相互作用。



以上方法通常相互补充，多种方法共同确定蛋白质间的相互作用，也能更大程度的避免假阳性结果。

GST pull-down技术实验服务研究案例—客户文章解析

GYS2/p53负反馈环抑制HBV相关性肝细胞癌的肿瘤生长
研究背景

糖代谢异常是癌症的突出特征，作者前期研究发现肝细胞癌(HCC)中的糖原含量降低，并与患者总体生存情况不良相关。探索HCC中的异常糖代谢机制或许可以为肝细胞癌的治疗提供新的靶点。

研究路线


RNA-seq和qPCR等结果显示HCC组织中的GYS2(糖原合成酶2)显著下调，并与患者不良预后相关

细胞和小鼠实验表明GYS2的缺失促进了肝癌细胞增殖和肿瘤生长

GYS2敲除细胞的RNA-seq实验发现p53通路都受到明显抑制

Co-IP和 GST pull down证明GYS2通过与p53的直接相互作用发挥肿瘤抑制功能

CO-IP和GST pull down实验发现GYS2、p53和E3泛素连接酶MDM2相互作用形成复合体，GYS2与p53竞争结合MDM2来抑制p53泛素化，稳定p53蛋白水平

荧光素酶和ChIP等实验表明p53蛋白结台GYS2启动子，通过p300介导的乙酰化，在转录水平上抑制GYS2

对HBV阳性肝中的关键致癌蛋白HBx的研究发现,HBx、HDAC1与乙酰化的p53相互作用,共同抑制了GYS2

研究结论
本研究售次报道了HCC组织中糖原含量显著降低，并与不利的患者预后相关，这归因于新发现的HBx/GYS2/p53信号轴。低表达的GYS2促进HCC细胞增殖而非迁移，并提供了两条独立的证据线来支持GYS2和p53之间的关系。一方面，GYS2与MDM2竞争结合p53，以稳定p53免于蛋白酶体降解；另一方面，p53以负反馈方式抑制GYS2表达和糖原含量。这些数据表明p53和GYS2可能通过平衡彼此的表达而在HCC中发挥功能。


客户文献
Chen S.L. et al: A GYS2/p53 Negative Feedback Loop Restricts Tumor Growth in HBV-Related Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research. 2018. (IF=12.701).